1. 抗生素敏感性测试

       1.1 从二氧化碳培养箱中取出细胞，镜下观察细胞生长状态，胰酶消化后计数，2*10^5/孔，铺24孔板，37℃培养过夜，浓度预设为：0 μg/ml、1 μg/ml、2 μg/ml、4 μg/ml、8 μg/ml、10 μg/ml，不同细胞对于抗生素敏感性不同如未测试出合适的puro可提高puro梯度浓度。

       1.2 根据细胞生长状态，2-3天更换完全培养基，并加入对应浓度的puro，持续观细胞状态，一般在4~6天内确定有效杀死非转染细胞的药物最低浓度。

2. 病毒液感染细胞

       2.1 首先进行目的质粒的转染，包装慢病毒，收集病毒液。

       2.2 从二氧化碳培养箱中取出细胞，镜下观察细胞生长状态，胰酶消化后计数， 2~4*10^5/孔细胞量，铺于12孔板，加入50ul的病毒液，隔天更换新鲜培养 基培养24h后。加入确定有效杀死非转染细胞的puro药物浓度筛出转染细胞， 此时细胞为多克隆细胞。并验证是否过表达，每种细胞系的验证实验不同，根据实际进行实验。

3. 单克隆筛选

       3.1 多克隆细胞经验证后进行单克隆筛选，可通过有限稀释法，稀释至50个细胞 /10ml在96孔板中，每孔100μL。单克隆增殖后再进行验证，选出表达量较高的单克隆细胞扩大培养并冻存。

免疫印迹法（Western blot），是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。免疫印迹实验的原理是利用特定抗体能够专一结合其抗原蛋白质的原理来对样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息，来分析检测特定蛋白质的生物学检测技术。

简单来说，免疫印迹实验是通过抗体与抗原之间的特异性结合来检测目标蛋白质。这个过程通常包括将蛋白质样品通过SDS-PAGE电泳分离，然后将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如PVDF膜或硝酸纤维素膜）上。然后使用特异性抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行结合，再使用标记的二抗与一抗结合。最后，使用适当的底物进行显色或发光以检测目标蛋白质。